通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒 T4原理載體
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通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒
通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒 T4原理載體
目錄號：42015
試劑盒組成、儲存、穩定性：
組成 | 80次-100次 (V015-100) | 400次-500次 (V015-500) |
2 × Taq PCR MasterMix | 1ml | 5ml |
Universal primer F | 50ml | 250ml |
Universal primer R | 50ml | 250ml |
ddH2O | 1ml | 5ml |
儲存：-20 ℃ 保存。
產品介紹：
菌落PCR鑒定是T載體克隆連接后鑒定是否有陽性克隆（含插入片段）zui方便快捷的方法。但是市面上能見到的菌落PCR鑒定試劑盒采用的都是T3,T7或者SP6等特異T載體引物，只能用于某種特定T載體連接陽性克隆的鑒定。如果使用不同T載體，便需同時購買多種鑒定試劑盒，大大增加了使用成本。本公司采用通用T載體引物研制的通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒，只需購買一種試劑盒，便可用于市面上所有常見的T載體(包括pGEM，pUC，pBluescript系列) 連接陽性克隆的鑒定。此外，采用T3,T7或者SP6做引物的菌落PCR鑒定試劑盒引物距離插入位點的距離非常短，因此在鑒定100bp左右或者更小片段的插入時，陰性克隆的引物二聚體條帶和陽性克隆擴增條帶大小接近，無法區分。往往把引物二聚體的條帶看成是陽性擴增條帶，造成假陽性。反之，造成假陰性。本試劑盒通用T載體引物在未插入片段時的距離至少有150bp以上，加上插入片段的長度，可以清晰的區分是插入片段擴增出的條帶還是引物二聚體擴增出的條帶。避免假陽性或者假陰性，大大提高了準確性。本公司研發的一管便攜式PCR MasterMix預混系統，無需您一一加入各種成分，直接加入需篩選單菌落，經過1小時左右的PCR反應和電泳檢測即可得到重組菌落鑒定的結果。
預期擴增片段：
T載體名稱 | 載體來源 | 未插入片段時 通用T載體引物間距離 | 預期擴增片段長度 （以插入300bp片段舉例） |
pGEM-T Easy | pGEM | 281bp | 581bp |
pGEMX-T Easy | pGEM | 289bp | 589bp |
pMD18-T | pUC18 | 158bp | 458bp |
pMD19-T | pUC19 | 158bp | 458bp |
pSURE-T | pUC19 | 239bp | 539bp |
pUCm-T | pUC19 | 239bp | 539bp |
pBLUE-T | pBluescript | 300bp | 600bp |
注意事項：
1. 重組菌落鑒定時，挑取單菌落前，應先做好標記，便于鑒定后使用。
2. 挑取菌落時，應選擇單菌落，不要挑取太多菌體，以免影響PCR結果。
3. 設定PCR 程序時，請根據插入片段大小決定延伸時間，如果插入片段大小為1 kb 以下，延伸時間30-45 秒即可，如果片段更長，可按此比例增加延伸時間。
操作步驟（以25ml體系舉例，客戶也可以采用20ml體系）：
1. 按以下體系配好含有引物的1 x Taq MasterMix 反應液。
2 × Taq PCR MasterMix | 12.5ml |
UniversalprimerF(10mM) | 0.5ml |
UniversalprimerR(10mM) | 0.5ml |
ddH2O | 11.5ml |
2. 將過夜培養的平板上的菌落編號后，使用滅菌的槍頭挑取一部分單菌落加入上述反應液，吹打混勻使菌落充分分散到反應液中。
可多設置一管不加菌落的陰性對照，以便于分析實驗結果。
3. 將PCR管置于熱循環儀上按以下條件開始反應，建議條件如下：
94℃ 10 min
94℃ 30 sec
55℃ 30 sec 30-33 cycles
72℃ 0.5-1 min
72℃ 5 min
注意：延伸時間請根據插入片段大小調整。預變性時間延長到10分鐘，主要是為了裂解菌落，釋放DNA模板。
反應結束后，取5-10ml直接上樣電泳檢測。
注：如果細菌難裂解或者雜質多假陰性，嘗試下面的方法，裂解釋放DNA后進行。
1. 挑取菌落加入 50ml dd水 （或者10ml dd水中），振搖。
2. 99度，10分鐘滅活菌液中的酶，并釋放DNA。
3. 12000rpm離心1分鐘去除細胞碎片。
4. 取上清PCR，25ml PCR體系取5ml上清（起始50ml dd水），或者1ml上清（起始10ml dd水）做模板。
通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒 T4原理載體
